【作者】周燚 孙明 喻子牛
【摘要】AiiA 蛋白通过破坏病原菌的信号分子来阻断病原菌的群体感应调节系统,达到抗病的目的,是一种新型的抗病蛋白. 根据蜡状芽胞杆菌ATCC14579 基因组中aiiA 序列设计引物,从苏云金芽胞杆菌中成功扩增出aiiA 基因,其ORF 为753 bp, 测序后经blast 检测与已发表的序列相似性均在95 % 以上. 将此基因克隆到pET28a 表达载体中,转化大肠杆菌BL21 (DE3) ,经IPTG 诱导,超量表达的蛋白在菌体中以包涵体形式存在,纯化的AiiA 蛋白经SDS2PAGE 电泳检测,表达产物分子量为28 ×10³ ,致病性测定表明该蛋白对魔芋软腐病菌CZY 具有较强的抗病活性.
【关键词】苏云金芽胞杆菌; AiiA 蛋白; 魔芋软腐病菌CZY;

　　细菌根据特定信号分子的浓度可以监测周围环境中自身或其它细菌的数量变化,当信号达到一定的浓度阈值时,能启动菌体中相关基因的表达来适应环境中的变化,这一调控系统被称为细菌的群体感应调节系统(quorum-sensing system ,QS) ^[1] . 革兰氏阴性(G^-) 细菌中的QS 系统由酰基高丝氨酸环内酯(acyl-homoserine lactone ,AHL) 类信号分子及其受体蛋白组成. AHL 分子的典型特征是含有高丝氨酸内酯环和一个酰胺链,高丝氨酸内酯环是这类化合物共有的特性^[1] .
        研究表明胡萝卜软腐欧文氏菌( Erwinia caro tovora) 中果胶酶、纤维素酶、多种蛋白水解酶及碳青霉烯抗生素(carbapenem) 的产生受到QS 系统的调控^[2] . 在胡萝卜软腐欧文氏菌中QS 系统中信号分子AHL (C10 H15O4N) 与ExpR 受体蛋白结合促进致病胞外酶的表达,与CarR 受体蛋白结合促进碳青霉烯抗生素的产生^[3] ,这些胞外酶与抗生素的产生是软腐类病原菌成功侵入寄主并繁衍种群的关键因子.
        Dong 等^[4] 报道了一种芽胞杆菌240B1 能产生降解AHL 信号分子的胞内解酯酶AiiA 蛋白,这种酶能使胡萝卜软腐欧文氏菌产生的AHL 分子内酯键被打开,因此,软腐病菌中受QS 系统调控的致病基因与碳青霉烯抗生素基因不能表达,从而极大减弱了该病菌的致病性. 在此基础上,该课题组把aiiA 基因转入烟草、马铃薯中,获得了抗软腐病能力较强的植株^[5] . 本文在检索已发表的蜡状芽胞杆菌( B. cereus)ATCC14579 基因组序列中也发现了与aiiA 基因相似的序列(3409487～3410239) ,因为苏云金芽胞杆菌( B. thuringiensis) 与蜡状芽胞杆菌非常近似,所以对苏云金芽胞杆菌进行了抗病性检测,发现该菌也有一定的抗病性,籍此本文对苏云金芽胞杆菌的aiiA 基因进行了克隆与表达,表达的产物表现了较好的抗病性.

1 　材料和方法

1.1菌株与质粒
        菌株E. coli DH5a、E.coli BL21(DE3)、苏云金芽胞杆菌BMB171 ,魔芋软腐病菌Erwinia carotovora pv. carotovoraCZY, 以上菌株均为本室保藏. 质粒pET28a ( +) ( 卡那霉素抗性,含T7 启动子,购于Novagen 公司) 、p GEM T2vector (Ampr ,LacZ 互补, 购于promega 公司).大肠杆菌在37 ℃培养,苏云金芽胞杆菌、魔芋软腐病菌均在28 ℃培养. 大肠杆菌、苏云金芽胞杆菌和魔芋软腐病菌CZY 用LB 培养基培养. 抗生素使用浓度:卡那霉素为50 mg/ L.

1. 2 　DNA 操作及蛋白电泳
        质粒的提取、酶切、连接、转化、PCR 扩增和蛋白SDS2PAGE 电泳均参照文献^[6] 的方法进行.

1. 3 　aiiA 基因的克隆和表达
        根据蜡状芽胞杆菌ATCC14579 中aiiA 序列设计引物, primer1 : 5’ GTCGGATCCATGACAGTAAAGAAGCTTTA3’, primer2 : 5’ GTCGCGGCCGCCTATATATACTCAGGGAACA3, 从筛选到的具有较强抗软腐病活性的苏云金芽胞杆菌H38 中扩增aiiA 基因,利用Bam H Ⅰ与Not Ⅰ位点插入质粒pET28a ( +) 中,转入大肠杆菌BL21 (DE3) 中用IPTG 诱导表达AiiA蛋白.

1. 4 　AiiA 蛋白的提取和纯化
        挑取单菌落接入5 mL 含卡那霉素的LB 培养基中,37 ℃过夜培养,按1∶100 比例转接到新鲜LB 培养基中(约100 mL, 卡那霉素抗性) ,200～300 r/ min 摇4h 左右(OD 值0. 6～0.7) ,加IPTG 至终浓度0.8 mmol/L , 诱导培养3 h, 于8000 r/ min 、4 ℃下离心5 min , 弃上清,加入1/ 10 体积pH8. 0 的TE 溶液洗涤一次,加入20 mL pH8.0 的TE 溶液重悬, 加入终浓度5 mmol/ L 的DTT 和1 %TritonX2100 用细胞破碎仪于2000 压力下破碎细胞, 加19. 7 mL 缓冲液A ( 50 mmol/ L Tris2HCl,0. 5 mmol/L EDTA,0.5 mmol/L DTT,50 mmol/L NaCl,5% 甘油) 和0.3mL 20%N-十二烷基肌氨酸钠贮存液, 剧烈搅动重悬,使沉淀缓慢溶解,4 ℃静置过夜,1 200 r/ min 、4 ℃下离心10 min, 弃沉淀,加入PEG 4000 ( 终浓度0. 2%) 、氧化型谷胱甘肽(终浓度1 mmol/ L) 、还原型谷胱甘肽(终浓度2 mmol/ L ) ,静置2h 以上,以PBS 缓冲液透析3 天(中途换3 次透析液),取出置-20 ℃备用.

1. 5 　魔芋软腐病菌致病性测定
        马铃薯块的制备:取大小适当的马铃薯若干,用水仔细清洗、晾干. 再用70 %( V/ V ) 乙醇进行表面消毒30 min. 在无菌操作台上,用无菌刀片将马铃薯切成厚度约为10 mm 、角度大约为90 度的锥形片状,放入无菌水中充分漂洗,在无菌滤纸上吸干水分. 然后将处理好的马铃薯块放入平板中待用.
感染样品的制备与接种:取魔芋软腐病菌CZY 的16 h 培养物(OD 约为0. 6～0.7) ,稀释4 倍,取20μL 与同体积的AiiA 蛋白溶液或者苏云金芽胞杆菌菌株H38 (OD 值约为0. 7 左右) 混合,28 ℃作用4h 后,各取5μL 混合物接种马铃薯. 同时将魔芋软腐病菌CZY 的4 倍稀释液与无菌水的混合物接种马铃薯作为对照. 将平板放在28 ℃培养,24 h 后观察并记录马铃薯是否出现软腐病斑及感病的程度.

2 　结果与分析

2. 1 　aiiA 基因的克隆及测序
        根据蜡状芽胞杆菌ATCC14579 基因组序列中aiiA 基因的序列设计引物,以苏云金芽胞杆菌H38 的总DNA 为模板进行PCR 反应,扩增出一条与预计大小(753 bp) 相符的DNA 片段,与T 载体连接, 转化E. coli DH5α,序列分析显示该基因即为aiiA 基因的编码区,该基因已在GenBank 登录(登录号A Y195570) . 以同样的方法测定了苏云金芽胞杆菌H42 、BMB171 和CTC 菌株中aiiA 基因的序列,其登录号依次为AY195571 、AY198412 、AY460124. 经BLAST 检测,其相似性均在95 % 以上.

2. 2 　构建aiiA 基因的原核表达载体
        将含aiiA 基因的T 载体经Bam H Ⅰ与Not Ⅰ酶切,所得外源片段与用Bam H Ⅰ与Not Ⅰ酶切的pET28a ( +) 载体相连,转化大肠杆菌DH5α,筛选插入aiiA 基因的阳性克隆,所获得的重组质粒命名为pET28AiiA(图1, 酶切验证见图2) . 抽提转化子的质粒,转化大肠杆菌BL21 (DE3) 受体菌,获得表达aiiA 基因的菌株.

2. 3 　aiiA 基因在大肠杆菌BL21 中表达和纯化
        将含pET28AiiA 质粒的BL21 (DE3) 工程菌,培养至对数生长末期经IPTG 诱导后,经破碎、溶解变性、除杂、复性等过程得到较纯的AiiA 蛋白,与上样缓冲液处理后经SDS2PAGE 分析表明,大量表达的AiiA 蛋白分子量为28 ×103 左右(图3) ,与理论推测值一致.

3 　讨　论

        胡萝卜软腐欧氏杆菌的寄主范围很广,危害严重,由其导致的软腐病往往是一种系统性病害,难以防治,给农业生产带来灾难性的影响. 现在魔芋产业的发展主要受到魔芋软腐病的威胁,目前生产中还没有防治该病的特效药剂,同时也没有找到有效的魔芋抗病种质资源,只能依靠农业综合措施来减轻其发病程度. 如何有效防治此病,前人已做了很多工作^[7] , 但魔芋软腐病每年仍然爆发成灾. 因为该病往往从球茎及根部发病,而一般的化学药剂即使在室内效果很好,施到土壤中后,也难以作用到魔芋发病的部位,所以防效甚微. 现在魔芋产业要想快速发展,必须尽快克服软腐病的困扰. 现在从苏云金芽胞杆菌中克隆到的aiiA 基因主要作用于病原菌的AHL 信号分子,使其开环而丧失信号分子的功能,导致病原菌的致病基因不能启动表达,室内检测的结果也表明AiiA 蛋白能较好的抑制魔芋软腐病菌的致病性. 这一新型的抗病途径为魔芋软腐病的防治带来了新的希望,同时也大大拓宽了苏云金芽胞杆菌的应用范围.

 【参考文献】

[1]Miller M B , Bassler B L . Quorum Sensing in Bacteria [J ]. A nnu Rev Microbiol ,2001 ,55 :165-199.
[2]VonBodman SB,Bauer WD,CoplinDL.QuorumSensing in Plant-Pathogenic Bacteria [J ].A nnu Rev Phytopathol ,2003 ,41 :455-482.
[3]WelchM,ToddD E,WhiteheadNA,et al .N-acyl Homoserine Lactone Binding to the CarR Receptor Determines Quorum-Sensing Specificity in Erwinia[J ]. EMBO J ,2000 ,19 (4) :631-641.
[4]Dong Y H，XuJ L ,Li X Z,et al. AiiA，an Enzyme thatInactivates the Acylhomoserine Lactone Quorurrr-Sensing Signal and Attenuates the Virulence of Erwinia Carotovcra[J].Proc Natl Acad Sci USA ,2000 ,97 :3526-3531.
[5]Dong Y H , Wang L H，Xu J L，et al. Quenching Quorum-Sensing-Dependent Bacterial Infection by an N-Acyl Homoserine Lactonase [J]. Nature, 2001, 411(6839):
[6]Sambrook J, Russel D W. Molecular CLoning:A Laboratory' Manual. 3tdred[M].New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001.
[7]王少南.魔芋及其病害研究进展[J].广西农业科学,2004,35 (1) :68-70. Wang Shao-nan. Proceeding of Amorphophallus Konjac and  Its Disease [J]. Guangxi Agricultural Sciences, 2004 ,35(1):68-70 (Ch).

Activity of Bacillus thuringiensis AiiA ProteinAgainst Soft Rot Disease for Amorphophallus konjac
Caused by Erwinia .carotovora pv.carotovora

Abstract : AiiA protein , blocking the bacterial quorum sensing by hydrolyzing AHL-lactone , can greatly attenuate the disease caused by many bacterial pathogens in which quorum sensing regulate the expression of virulence genes. The primers were designed from the sequence of aiiA gene in genome of B . cereus A TCC14579 , and the 753 bp long gene segment was amplified from Bacillus thuringiensis by PCR using EX-Taq DNA polymerase. The comparability of aiiA gene from B . thuringiensis is very high with others. The PCR segment was inserted into expression vector pET28a (+).Then the recombinant vector pETAiiA was introduced into E. coli BL21 (DE3) for expression. SDS-PAGE showed that the expression product was a band of about 28 ×103 protein. The expression protein greatly attenuated the pathogenesis of E. carotovora pv. carotovora CZY which can result in soft rot for Amorphophallus konjac.
Key words : Bacillus thuringiensis ; AiiA Protein ; Erwinia carotovora pv. carotovoraCZY